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Differenzierung von Körperflüssigkeiten aus forensischem Material mit gewebespezifischen Methylierungsmarkern
(peripheres Blut, Menstrualblut, Vaginalflüssigkeit, Speichel, Sperma, Samenflüssigkeit, Haut)

Die unten beschriebene Methode wird einschließtlich aller Validierungsexperimente geschildert in PLOS one Published: February 1, S Forat et al. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0147973 2016

Methylation Markers for the Identification of Body Fluids and Tissues from Forensic Trace Evidencen

Biologische Tatortspuren sind meist vielfältigen äußeren Einflüssen ausgesetzt gewesen. Damit kommen die üblichen Methoden zur Identifizierung von Geweben nicht mehr in Frage. Auch RNA ist als Analysensubstrat unter diesen Umständen nicht geeignet. Dagegen ist das Untersuchungsmaterial der Methylierungsanalyse die extrem stabile DNA. Wir haben für die unten angegebenen Körperflüssigkeiten jeweils mindestens zwei Methylierungsmarker entwickelt, die auch unter forensischen Bedingungen deren Gegenwart in Spuren nachzuweisen und zu messen erlauben.

Gewebe/Körperflüssigkeiten unterscheiden sich voneinander durch Art und Anzahl der in ihnen aktiven Gene. Über Aktivität bzw. Inaktivität eines Gens entscheiden oft Methylgruppen in der Nähe eines Gens. Methylierungsmarker zeigen an, ob bei einem solchen Gen eine Methylgruppe vorhanden ist oder nicht. Wir haben diese Marker-Loci nach der Auswertung von zwei genomweiten Methylierungsstudien ausgewählt. Für jede Körperflüssigkeit haben wir dabei jeweils zahlreiche CpG-Positionen ermittelt, die im Prinzip eine Bestimmung der jeweiligen Körperflüssigkeit bzw. eine Unterscheidung von den übrigen relevanten Körperflüssigkeiten gestatten sollte. Wir haben dann nach eingehenden molekularbiologischen Studien und Validierungstests für jede Körperflüssigkeit − zwei differenzierende Loci ausgewählt: Der erste Marker charakterisiert sein Material durch ein Methylierungssignal- die differenzierende CpG-Stelle ist methyliert - der zweite Marker durch eine nicht-methylierte CpG-Position. Diese Analysenstrategie gewährleistet eine sichere Bestimmung auch noch bei störenden Einflüssen, die beispielsweise den Grad der Methylierung mindern könnten. In Abbildung 1 ist die Anwendung eines Methylierungsmarkers dargestellt, der den Nachweis von peripherem Blut und die Bestimmung von peripherem Blut aus Mischungen mit anderen Körperflüssigkeiten gestattet.

Abbildung 1

Der blaue Peak zeigt die Gegenwart von peripherem Blut an (1 a). Natürlich enthält Menstrualblut ebenfalls Komponenten peripheren Blutes; deswegen ist hier auch ein kleiner blauer Peak sichtbar (1 b). Die übrigen Körperflüssigkeiten weisen keinen Methylierungs-Peak auf. Die klare Unterscheidung zwischen peripherem Blut und Menstrualblut erfolgt mit einem speziellen Menstrualblutmarker. Der zweite Marker zur Identifizierung von peripherem Blut reagiert zum ersten Marker komplementär: Er zeigt reines peripheres Blut durch einen nicht methylierten grünen Peak an (1 a). Dagegen zeigt sich bei allen anderen relevanten Körperflüssigkeiten daneben ein blauer Peak, der Methylierung an diesem Locus bedeutet.

Abbildung 2

In Abbildung 2 wird die Reaktion des zweiten Markers dargestellt. Reines peripheres Blut zeigt einen grünen Peak, der Nichtmethylierung am betrachteten Genort anzeigt (2a). Menstrualblut und Vaginalflüssigkeit zusätzlich zum grünen Peak für Nichtmethylierung einen blauen Peak für Methylierung (2b, c) Speichel, Sperma und Haut haben nur noch kleine Anteile des grünen Peaks und praktisch nur noch den blauen Peak für Methylierung (2 d-f).

Mischungen - das Zusammenwirken der einzelnen Marker

Abildung 3

   Marker 1         Marker 2

In Abbildung 3 wird am Beispiel der beiden zueinander komplementären Blutmarker dargestellt, wie sich deren Aussagen ergänzen. Bei reinem peripherem Blut zeigt Marker 1 das blaue Signal der Methylierung (3 a) und Marker 2 das grüne Signal der Nichtmethylierung (3 b). Ist in einer Mischung peripheres Blut neben anderen Körperflüssigkeiten vorhanden, zeigt Marker 1 wieder beide Signale (3 c), und Marker 2 ebenfalls beide Signale (3 d). Enthält dagegen eine Mischung aus Körperflüssigkeiten kein peripheres Blut, fehlt der blaue Methylierungsanteil (3 e), während Marker 2 wieder beide Signale zeigt.

Wie viel Spurmaterial wird für eine Untersuchung benötigt?

Je nach Art bzw. Menge der Spur und abhängig von der Fragestellung sollte man die analytische Vorgehensweise entwerfen. Handelt es sich um eine Spur mit beispielsweise einem geschätzten Volumen von 1 µL Blut oder Sperma so kann man von einem Gehalt von 5-10 ng genomischer DNA ausgehen. Damit könnte man alle 16 Marker einsetzen und deren Informationsgehalt nutzen. Pro Marker benötigen wir im Augenblick mindestens 200 pg DNA für eine stabile Analyse. Geht man bei der zur Debatte stehenden Spur z.B. primär von Speichel aus, ist der DNA-Gehalt pro Volumen erheblich geringer. Dementsprechend würde man eventuell die Fragestellung fokussieren auf Speichel, Sperma, Vaginalflüssigkeit und würde nur die dafür vorgesehenen Marker einsetzen. Wir arbeiten an einer Multiplexanalyse, bei der man immer simultan alle Marker einsetzt. Damit wird die erforderliche DNA-Mindestmenge für den gleichzeitigen Gebrauch aller Marker von gegenwärtig 3 ng erheblich herabgesetzt.

Wie wirken sich die üblichen exogenen Einflüsse aus, denen eine biologische Spur ausgesetzt ist?

Wir haben die zur Debatte stehenden Körperflüssigkeiten bis zu 6 Monate lang typischen Umweltbedingungen ausgesetzt (Setzer et al 2008).

Simulierte Umwelt-Faktoren:

RT, lichtgeschützt, in Plastik-Tüten, trocken RT, Tageslicht, in Exsikkator, feucht draußen, wetterbedingte Umgebung
(Sonne, Regen, etc.), auf Erde

Lagerung für 1, 2, 3 und 6 Monate (für 16 Mo noch ausstehend) und UV-Licht − Bestrahlung

Über den gesamten Zeitraum zeigten sich die Körperflüssigkeiten außerordentlich stabil und erlaubten den Nachweis per Methylierungsanalyse. Starke Verluste zeigten sich naturgemäß; bei Proben, die auf Erde aufgebracht worden waren und über den gesamten Zeitraum an freier Luft allen Witterungseinflüssen wie Regen und Sonne ausgesetzt waren. Hier waren manche Proben völlig ausgewaschen, während andere noch ihre charakteristische Reaktion zeigten.

Setzer M, Juusola J, Ballatyne J, J Forensic Sci, 2008, 53, 2, 296

Welche Faktoren können den Methylierungsgrad beeinflussen?

Die von uns beschriebenen Methylierungsmarker sind in Wirklichkeit zellspezifisch. Unser Analysenmaterial, also die Körperflüssigkeiten bestehen aber mit Ausnahme der Samenflüssigkeit aus mehreren unterschiedlichen Zellarten. Abhängig von der physiologischen Situation, in der sich der Probenleger befand, muss man mit variierenden Anteilen dieser spezifischen zellulären Substrate rechnen. Das bedeutet, das Detektionssignal des Methylierungsmarkers ist ebenfalls Schwankungen ausgesetzt. In einem gesunden Organismus kann man von einer Normalverteilung dieser Werte ausgehen. Wir haben 25 bis 30 Proben aller hier zur Diskussion stehenden Materialien mit allen Markern analysiert. In keinem Fall ist durch die physiologische Schwankung der Werte auch nur annähernd eine Minderung der Aussagekraft der einzelnen Marker denkbar. Prinzipell können auch genetische Varianten das Ergebnis einer Methylierungs-Analyse beeinflussen. Dabei sind zwei Wege denkbar: Zum Einen könnte ein Allel eines SNP (aus dem Englischen: Single Nucleotide Polymorphism) die Nachweisreaktion direkt stören, nämlich an einer Primerbindungsstelle der PCR-Primer oder der SNuPE-Primer. Zum Anderen könnte ein SNP-Allel den Methylierungsgrad selbst beeinflussen. Letzteres gilt auch für Mikrosatelliten. Diese potentiellen Störfaktoren haben wir bei der Suche nach unseren differenzierenden Markern insofern berücksichtigt als wir nach Möglichkeit solche Genorte gewählt haben, für die keine SNPs beschrieben worden sind. Relevant war für diese Auswahl die Position der Amplifikations-Primer und die der SNuPE-Primer. Die Präsenz eines SNPs haben wir toleriert, wenn sich beide Allele als Methylierungs neutral erwiesen. Auch pathologische Zustände können theoretisch auf den Methylierungs - Status einwirken. Defekte der Methyl-Transferase und Tumoren beeinflussen generell das Methylierungsmuster betroffener Zellen. Wir haben zahlreiche unterschiedliche Tumorarten getestet: Die Aussagekraft der einzelnen Marker blieb unverändert. Als allgemeinere Absicherungsmaßnahme gegen solche Faktoren dient unsere Strategie der komplementär wirkenden Marker: Der erste zeigt seine spezifische Flüssigkeit durch einen methylierten Genort an, der zweite durch einen nicht methylierten.